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基因表達調控 非編碼RNA circRNA測序

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       circRNA是一大類非線性RNA,作為調控因子發揮著巨大作用。circRNA具有大量存在,進化保守,在細胞質中相對穩定的特點。這使得circRNA具有許多的功能,例如作為miRNA的海綿,綁定RNA形成RNA-蛋白復合物,調控基因的轉錄。circRNA測序能夠在整體水平上解釋樣品中circRNA的分類信息、表達量信息等,通過分析其與miRNA的互作關系探討ceRNA調控機制。 

適用范圍

  基礎研究:

   1人類正常組織、細胞、發育階段的circRNA表達譜

   2疾病或者腫瘤組織中環狀RNA表達譜

   3circRNA的功能和調控機制研究

  臨床運用:

   1新型的分子標志物 

技術優勢     

  1)文庫優化:采用核糖體去除、鏈特異性文庫構建、以及RNase R消化方案,全面捕捉circRNA片段

  2)物種多元:可以檢測幾乎任何動植物的環狀RNA

  3)結果精準:多款circRNA預測鑒定軟件

  4)ceRNA機制:多種ncRNA聯合分析,全面解讀生命現象

  5)經驗豐富,實驗流程成熟,數據可靠


實驗流程

生信分析

技術參數

樣本要求

動物:≥1 g

植物:≥2 g

真菌:菌絲或者菌體稱重(每管200 mg),≥3

全血:≥ 2 mL

細胞: 5×106 cells

RNA要求

μg200 ng/μL

建庫測序

去核糖體,去線性,鏈特異性文庫,Illumina PE150測序

數據量

10G clean data


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論壇

案例一:環狀RNA標記預測胰腺導管腺癌對吉西他濱的耐藥性研究


吉西他濱是一種晚期胰腺癌重要治療藥物,在疾病治療過程中起重要作用。本篇文章作者首先獲得吉西他濱的耐藥細胞株,通過測序手段對比耐藥細胞株和正常細胞株中環狀RNA的表達譜。作者選取差異表達前10的環狀RNA進行環狀RNA定量PCR驗證測序結果,準確性高達100%,說明測序結果真實可靠。

 

研究思路:

 

 

分析結果:

 

PANC-1-GR細胞與親代PANC-1細胞的circRNA表達譜,差異基因表達分析顯示,126circRNA在這兩種細胞系中的表達存在顯著差異,與PANC-1細胞相比,PANC-1-GR細胞中有68種上調,58種下調。

 

利用TargetScan進行序列分析,分析兩個circRNAs的潛在結合miRNAs,結果預測chr14101402109-101464448Cchr452729603-52780244C能夠結合一系列已知功能的miRNA,提示它們在PDAC對吉西他濱耐藥中的潛在作用。

 

案例二:脫水脅迫下小麥葉片環狀RNA及其靶標的鑒定


河南農業大學的研究團隊利用環狀RNA測序,首次在小麥幼苗葉片中鑒定出大約88個環狀RNA分子,而在脫水脅迫幼苗中有62個環狀RNA分子存在差異表達。在脫水反應的環狀RNA分子中,有6個在小麥中作為26個相應的miRNA的海綿。利用qPCR驗證16個環狀RNA,包括6miRNA海綿和10個隨機選擇的環狀RNA,其中14個環狀RNA與測序結果趨勢一致,反應測序數據的真實性可靠性。GO分析和KEGG分析揭示circRNAs潛在的生物學功能,例如所涉及的參與脫水反應過程,如光合作用,葉綠素代謝,氧化磷酸化,氨基酸生物合成、代謝以及植物激素信號轉導和生長素生物合成等。并且揭示了環狀RNA與小麥葉片脫水抗性相關功能基因表達之間關系。

 

研究思路:

 

分析結果:

 

根據序列讀數,通過CIRI軟件在兩個小麥葉片處理中共鑒定出88個候選的circRNAs。其中6個(6.8%)是由單個蛋白質編碼基因外顯子產生的外顯子CircRNA53個(60.2%)是由基因間區(基因間區CircRNAs)產生的,2個(2.3%circRNA由內含子產生,另兩個(2.3%)由單個蛋白質編碼基因的反義鏈產生,分別稱為內含子和反義circRNAs。其余25個(28.4%)的circRNA是由正義重疊區域產生的。

 

為了解與差異表達的circRNAs相關的基因功能,使用BLAST2GO軟件進行GO分析。GO功能分類從539個預測的mRNA中生成了843個注釋,其涉及參與脫水反應過程,如光合作用,葉綠素代謝,氧化磷酸化,氨基酸生物合成、代謝以及植物激素信號轉導和生長素生物合成等。

 

參考文獻:

[1] Shao F, Huang M, Meng F T, et al. Circular RNA Signature Predicts Gemcitabine Resistance of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma[J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 584.

[2] Wang Y X, Yang M, Wei S M, et al. Identification of Circular RNAs and Their Targets in Leaves of Triticum aestivum L. under Dehydration Stress[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 7(2024).

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